Analizo prisotnosti virusa v slini so delali na dva načina – z izotermalnim pomnoževanjem (RT-LAMP) in z obratno transkripcijo in verižno reakcijo s polimerazo, na kratko RT-PCR testom. Oba testa zaznavata prisotnost dednega materiala virusa, to je RNA, vendar RT-LAMP test ne potrebuje dragih aparatur, zadošča že vodna kopel.
Tekom preverjanja občutljivosti ene in druge metode se je izkazalo, da je občutljivost RT-LAMP metode dvajsetkrat nižja od RT-PCR metode. To pomeni, da RT-LAMP metoda zazna 200,000 virusnih delcev v mililitru sline, RT-PCR pa okoli 10.000 virusov. RT-LAMP je primerljiv s hitrim antigenskim testom. Trenutno se zato osredotočajo na določanje virusa v slini z RT-PCR metodo, ker je najbolj občutljiva.
Prva faza raziskave je že pod streho, druga pa se ravnokar začenja. O tem, kdaj bi tovrstno testiranje lahko uporabljali tudi pri nas in kakšne so njegove prednosti, smo govorili z izr. prof. dr. Mojco Benčina, raziskovalko na odseku za sintezno biologijo in imunologijo Kemijskega inštituta.
izr. prof. dr. Mojca Benčina
Kaj vas je napeljalo na raziskovanje možnosti testiranja na COVID – 19 iz sline?
Sedaj je že slehernemu Slovencu jasno, kako poteka test na okužbo z virusom SARS-CoV-2. Prva faza je odvzem vzorca, ki je običajno nosni bris. Druga faza je transport brisov v ustrezno opremljene laboratorije, kjer z RT-PCR metodo preverijo prisotnosti virusa. Tudi pri hitrih antigenskih testih je potrebno bris jemati iz nosne votline. Na testiranju je torej nujno medicinsko osebje in prostor.
Že zelo kmalu nam je postalo jasno, da bi lahko tovrstno diagnostiko poenostavili. Predvsem smo želeli poenostaviti jemanje vzorcev in edina res dobra alternativa je slina. Zastavili smo si vprašanje, ali bi lahko prisotnost virusa določali iz sline, torej brez pomoči medicinske sestre.
Predvsem smo želeli poenostaviti jemanje vzorcev in edina res dobra alternativa je slina.
Iz literature vemo, da je virus v slini prisoten, saj je slina transportno sredstvo za širjenje virusa v okolico. Govor ustvarja kapljice sline, s katerimi virus potuje po zraku. Vprašanje pa je, ali je v slini virusa zadosti, da ga lahko z odvzemom potrdimo ali ovržemo.
Se vam zdi, da imajo ljudje čutijo nelagodje pri brisu iz nosne votline?
Sam postopek brisa res ni preveč prijeten, boleč pa tudi ne. Večja težava je, ko se recimo večji kolektiv, denimo tovarna ali fakulteta odločita, da bi testirali vse zaposlene. To je velik zalogaj za osebje, ki vzorce jemlje.
Predstavljajte si, da bi vam delodajalec dal za domov posodico, v katero bi zjutraj zbrali tri kapljice sline. Posodico bi potem naslednji dan oddali na zbirnem mestu in čez par ur imeli rezultat o potencialni okužbi z virusom.
Predstavljajte si, da bi vam delodajalec dal za domov posodico, v katero bi zjutraj zbrali tri kapljice sline. Posodico bi potem naslednji dan oddali na zbirnem mestu in čez par ur imeli rezultat o potencialni okužbi z virusom. Na ta način se prihrani čas in testiranje postane vsaj za testiranca enostaven rutinski korak.
Kako daleč ste s testiranjem?
Prvi krog preverjanja smo že naredili. Preverjali smo, koliko sline potrebujemo, na kakšen način lahko slino zbiramo in kako občutljivi sta metodi detekcije RNA virusa v slini. Ta del je potekal na manjšem številu vzorcev. Nato smo se premaknili na COVID točko in z njihovo pomočjo in v sodelovanju z Nacionalnim laboratorijem za zdravje, okolje in hrano ugotavljali ujemanje naših rezultatov z uradnimi rezultati.
Preverjali smo, koliko sline potrebujemo, na kakšen način lahko slino zbiramo in kako občutljivi sta metodi detekcije RNA virusa v slini.
Na tem mestu bi se vsem, ki so vpeti v raziskavo zahvalila, kajti tudi, če gre za preprost postopek odvzema vzorca sline, to predstavlja za medicinsko osebje dodatno delo.
Kako postopek poteka?
Obstaja več načinov odvzema sline. Najbolj enostavno si slino odvzamemo sami s palčko, ki ima na koncu vpojno gobico. Druga še preprostejša metoda je, da oseba pljune v posodico. Potrebujemo le tri kapljice sline.
Tudi postopkov analize je več, izkazalo pa se je, da je najbolj zanesljiva RT-PCR metoda, ki se jo uporablja tudi v diagnostičnem postopku na nacionalnem nivoju. Pri tem vzorce sline samo skuhamo in dodamo v reakcijsko mešanico, brez kakršnega koli čiščenja.
Vzorce sline samo skuhamo in dodamo v reakcijsko mešanico, brez kakršnega koli čiščenja.
Rezultate vzorcev sline naknadno primerjamo z uradnimi rezultati in ujemanje je 70 – 80 odstotno, kar je dobro. Seveda si želimo boljšega ujemanja, zato smo se odločili še za en način vzorčenja.
Kaj ta odstotek pomeni v primerjavi z zanesljivostjo hitrih testov?
Ujemanje hitrih testov z RT-PCR testi je okrog 60 odstotno, kar ni slabo. Treba je vedeti, da je hitri antigenski test manj občutljiv. Na covid točke prihajajo testiranci z zelo različno količino virusa v dihalnih poteh.
Nekateri imajo visok virusni titer, nekateri zelo nizkega. Tistih, ki imajo zelo nizko število virusov v dihalih, hitri antigenski test ne bo zaznal. Naš test je učinkovitejši, zazna virus pri sedmih do osmih vzorcih od desetih.
Kje vidite bistveno prednost vašega testa?
Prednost vidim predvsem za množična testiranja – bodisi otrok, bodisi zaposlenih. Recimo, da se delodajalec preventivno odloči vsak teden testirati svoje zaposlene.
Prednost vidim predvsem za množična testiranja – bodisi otrok, bodisi zaposlenih. Morda nas čaka množično testiranje tudi v šolah, predvidevam, da nas čaka še tretji val.
Testiranje si predstavljam na način, v petek vsi zaposleni dobijo posodico za zbiranje sline, v ponedeljek pred prihodom v službo pljunejo v posodico in oddajo posodico na zbirno mesto. Posodice slino se odnese v laboratorij, kjer naredijo test in rezultate preko spletnega vmesnika sporočijo zaposlenim. Morda nas čaka množično testiranje tudi v šolah, predvidevam, da nas čaka še tretji val.
Ste razmišljali o logistiki testiranja?
Z nekaj zdrave pameti bi lahko vzorce sline zbirali zdravstveni domovi, civilna zaščita in verjetno še kakšna lokacija, ki ji ni delo z infektivnimi vzorci tuje. Na lokacijo, ki je dostopna množici, je potrebno postaviti primerno zbirno posodo, kamor do določene ure oddaš vzorec.
Z nekaj zdrave pameti bi lahko vzorce sline zbirali zdravstveni domovi, civilna zaščita in verjetno še kakšna lokacija, ki ji ni delo z infektivnimi vzorci tuje.
Preko spletne aplikacije se registriraš kot testiranec in ta aplikacija ti nato vrne rezultat, idealno, še isti dan. Izziv oziroma ozko grlo je druga faza analize, kajti v Sloveniji imamo le določeno število laboratorijev in aparatur, ki trenutno tako analizo lahko speljejo.
Izziv oziroma ozko grlo je druga faza analize, kajti v Sloveniji imamo le določeno število laboratorijev in aparatur, ki trenutno tako analizo lahko speljejo
Oprema, ki jo potrebujemo je dosegljiva v nacionalnih laboratorijih ter v večini raziskovalnih inštitucij, ki se ukvarjajo z raziskovanjem ved o življenju.
Dodaten izziv je, da mora te aparate nekdo upravljati, če bi recimo želeli dnevno obdelati 20 – 30 tisoč vzorcev, je za to potrebnih kar nekaj ljudi. Tukaj pa bi potrebovali posluh države, da se organizira mreža, ki je tudi komunikacijsko povezana.
Kako pa je trenutno s posluhom države?
Objavili smo, da bomo metodo validirali. Zaenkrat še nismo tako daleč, da bi se lahko konkretno pogovarjali kaj in kako. Vsekakor si želim, da bi na strani tako NIJZ, kot tudi Agencije za zdravila in medicinske pripomočke dobila sogovornike, ki bi podprli metodo kot dopolnilno metodo za detekcijo virusa v slini. Nato si želim, da bo tudi politika, pristopila in pomagala pri vpeljavi metode. Že na začetku razvoja smo izjavili, da smo znanje za netržne namene pripravljeni deliti.
Že na začetku razvoja smo izjavili, da smo znanje za netržne namene pripravljeni deliti.
Če povzamem, način vzorčenja sline je dober in rešuje pomankanja zbirnih mest in pripelje test na domači prag. Če odmislim politiko, vidim ozko grlo v mreži laboratorijev. Ker bi šlo za množično testiranje je vprašanje, kako razširiti mrežo laboratorijev izven trenutne nacionalne mreže, ki lahko take analize, kot je RT-PCR, izvajajo.
Postaviti bi bilo potrebno razširjeno mrežo laboratorijev, ki bi bili na nak način podrejeni nacionalni mreži, le te pa bi med seboj povezali preko spleta. S tem bi zagotovili obveščanje NIJZ, da bi se pozitivni rezultati ustrezno vrednotili.
Vedno se lahko zatakne na kredibilnosti laboratorijev, vendar gre trenutno za izredno situacijo, ko je nujno čimprej zaznati okužene in jih umakniti v samoizolacijo, da se ustavi širjenje virusa.
Vedno se lahko zatakne na kredibilnosti laboratorijev, vendar gre trenutno za izredno situacijo, ko je nujno čimprej zaznati okužene in jih umakniti v samoizolacijo, da se ustavi širjenje virusa. Vsaj dokler ne bo zadostne precepljenosti.
Bi lahko vaš test v celoti zamenjal hitre antigenske teste?
Hitri antigenski testi so in morajo ostati dopolnilo diagnostiki. Že ime pove zakaj – so hitri.
Test, ki temelji na vzorcih sline ni tako hiter, saj je še vedno druga faza vezana na enostavnejši RT-LAMP, ki traja 30 minut ali zanesljivejši RT-PCR, ki traja 1 uro, od takrat ko se analiza prične.
Hitri antigenski testi so in morajo ostati dopolnilo diagnostiki. Že ime pove zakaj – so hitri.
Prednost vzorčenja sline je, da se testiranje premakne na »domači prag«.
Kaj pa testi z LAMP metodo?
Sama sem pristaš občutljivosti, kar nam nudi RT-PCR detekcija. Vendar vsi nimajo aparature za izvedbo RT-PCR, v tem primeru je RT-LAMP iz sline vsaj tako zanesljiv kot antigenski test, če ne še bolj.
Teste na Kemijskem inštitutu trenutno izvajamo na oba načina. Glede hitrosti sicer RT-PCR nima prednosti, je pa zaradi občutljivosti odličen za množična tedenska testiranja, denimo v tovarnah, šolah, zavodih.
Prvo fazo validacije ste opravili, zdaj vas čaka druga. Kaj prinaša?
V prvem krogu smo preverjali, če je odvzem sline z najlonskimi palčkami ustrezen in če so rezultati iz tako odvzetih vzorcev primerljivi z uradnimi. Analize smo vzporedno izvajali na treh inštitucijah Kemijskem inštitutu, Nacionalnem inštitutu za Biologijo in Fakulteti za farmacijo.
Ugotovili smo, da je ujemanje dobro, ne pa odlično. Sedaj preverjamo, kako se ujemajo rezultati, če slino zberemo iz pljunka.
Ugotovili smo, da je ujemanje dobro, ne pa odlično. Sedaj preverjamo, kako se ujemajo rezultati, če slino zberemo iz pljunka. Glede na predhodne raziskave pa predvidevamo, da bo ujemanje višje od 80%. Če bomo zelo dobro ujemanje potrdili, sledi naslednji korak, ki pa je vezan na državne regulatorje.
Kakšen je postopek, da test postane diagnostičen?
Diagnostično metodo je najprej treba prijaviti Javni agenciji za zdravila in medicinske pripomočke, ki izda dovoljenje za uporabo testa. To dejansko pomeni, da jo lahko izvajalec uporablja v diagnostiki. Dokler nimamo dovoljenja, gre za raziskovalno-znanstveno metodo.
Če se metoda izkaže za zanesljivo in bo odobrena s strani agencije, pa je smiselno pozvati vse deležnike tudi NIJZ k razširitvi nabora metod, ki jih uporabljajo za diagnosticiranje okužb s SARS-Cov-2.
Kakšen časovni okvir do odobritve je za pričakovati?
Težko ocenim, ker s postopkom še nimamo izkušnje. Sodelujemo z Nacionalnim inštitutom za biologijo in Fakulteto za farmacijo, mislim, da bomo birokratsko rešitev hitro našli. Drugo fazo raziskave lahko končamo v štirinajstih dneh. Potrebujemo približno 500 testirancev.
Tudi drugo fazo odvzema vzorcev bomo izvajali v ZD Jesenice, ki so že od vsega začetka prisotni pri raziskavah in so nam z veseljem ponudili možnost sodelovanja. Poudariti pa moram tudi zelo dobro sodelovanje z ljubljanskim in novomeškim NLZOH, s katerimi neprekinjeno izmenjujemo informacije. Sedaj je aktualna tema, kako na najbolj preprost način zaznati druge seve virusa.
Sedaj je aktualna tema, kako na najbolj preprost način zaznati druge seve virusa.
Ocenjujem, da bomo čez kake tri tedne natanko vedeli, kje smo, potem pa je na potezi politika.
